Test
Test

تعیین جنسیت با بررسی خون مادر

مقدمه

در حال حاضردر اکثر کشورها تشخیص والدینی جنسیت جنین در چند ماه اولیه بارداری به منظور پیشگیری از بروز اختلالات ژنتیکی، در آزمایشگاههای ژنتیک پزشکی مورد توجه می­باشد. بهرحال روشهای معمول تهیه سلول­های جنینی برای بررسی ژنتیکی از جمله آمنیوسنتز و نمونه­گیری از پرزهای کوریونی روش­های تهاجمی بوده و خطر سقط و آسیب جنین وجود دارد (1).

در سال 1997 ، Lo و همکارانش توانستند حضور DNA جنینی آزاد را در سرم و پلاسمای زنان باردار را شناسایی نمایند (2). در تحقیقاتی دیگر، آنها نشان دادند که غلظت DNA جنینی با افزایش سن بارداری افزایش می­یابد (3) و DNA جنینی پس از زایمان بسرعت از پلاسمای مادر حذف می­گردد (4). با توجه به وجود DNA جنینی در میان انبوه DNA آزاد مادری موجود در پلاسما یک مانع بزرگ در راه کسب اطلاعات از این منبع، فقدان مارکرهای اختصاصی در تمایز این دو نوع DNA از نظر منشاء میباشد. با توجه به تمایز واقعی توالی­های DNA کروموزوم Y از DNA پلاسمایی مادر، بررسی­های زیادی بر پایه چنین توالی­هایی بعنوان مارکرهای اختصاصی DNA جنینی انجام شده است. این کارهای تحقیقاتی، یک روش تعیین جنسیت با صحت بالا را فراهم ساخت که برای بررسی والدینی بیماری­های وابسته به جنس مفید می­باشد. بررسی DNA آزاد پلاسمای مادر برای تعیین غیرتهاجمی وضعیت گروه خونی RhD جنین در زنان باردار RhD منفی نیز مفید می­باشد. تایید صحت این روش توسط تعداد زیادی ازگروه­های تحقیقاتی باعث گردید که اداره ملی خون انگلستان (British National Blood Service) آن­را بعنوان یک سرویس معمول از سال 2001 معرفی نماید. به تازگی بررسی DNA پلاسمای مادر به منظور تشخیص والدینی غیرتهاجمی بتا تالاسمی ماژور، HbE، میونیک دیسترفی، سیستیک فیبروزیس، بیماری هانتینگتون و هیپرپلازی مادرزادی آدرنال مورد استفاده قرارگرفته است (5،6) و چنین کاربردهایی در سالهای آینده گسترش بیشتری خواهد یافت. همچنین مدت کوتاهی پس از تعیین حضور DNA جنینی در خون مادران باردار، Lo و همکاران متوجه شدند که در آسیب­ها و ناهنجاریهای جنینی، DNA جنینی موجود در پلاسمای مادر از نظر کمی متحمل تغییر می­گردند (7). اولین آسیب جنینی که با تغییرات کمی DNAجنینی مشاهده گردید، پره­اکلامپسی بود که یک افزایش 5 برابری در غلظت DNA جنینی در آن رخ می­دهد. تغییر کمی DNA جنینی در جریان خون مادر همچنین در تغییرات تعدادی کروموزوم، زایمان پیش از موعد، هیپرامزیس گراویداروم و Placentation تهاجمی نیز مشاهده می­گردد. بنابراین مکان استفاده از غلظت DNA جنینی در پلاسما یا سرم مادران باردار برای پیش بینی خطرات بارداری وجود دارد (10-8). هدف از این تحقیق توسعه روشی بی­خطر برای تشخیص پیش از تولد جنسیت جنین می­باشد.

 

مواد و روشها ( تعیین جنسیت با بررسی خون مادر )

در این تحقیق تجربی، بر اساس موارد ذیل Nested-PCR برای ژن SRY انسانی طراحی و بهینه سازی گردید. ما با مراجعه به بانک اطلاعات ژنی، مقرهای مختلف واقع بر کروموزوم Y را مورد بررسی و ارزیابی قرار دادیم که از میان آنها ژن تعیین‌کننده جنسیت (SRY) که در مقر Yp11.3 قرار دارد، تعیین گردید. ژن (Sex determination region of Y) SRY یک ژن فاقد اینترون بوده که فاکتور رونویسی از خانواده پروتئین­های متصل شونده بهDNA، HMG را رمز می‌نماید. این ژن Kb 8/3 طول داشته و یک پروتئین 204 اسید ‌آمینه‌ای و 24 کیلودالتونی را رمز می‌نماید. این پروتئین تعیین جنسیت مذکر در انسان را آغازمی نماید.

5 میلی لیتر خون کامل همراه با ماده ضدانعقادEDTA  از 32 زن باردار درسنین بارداری بین 8 تا 13 هفته به روش  نمونه­گیری قابل دسترس با اطلاع و کسب رضایت آنها  جمع­آوری گردید. خون هر فرد بلافاصله در 3000 دور در دقیقه سانتریفوژ و پلاسما به میزان 500 میکرولیتر درون میکروتیوب­های استریل تقسیم گردید. به غیر از یکی مابقی میکروتیوب­ها به منظور تکرار بررسی در فریزر 20- درجه سانتی­گراد ذخیره گردید.

برای استخراجDNA از روش فنلی استخراج گردید. به 500 میکرولیتر پلاسما 10 میکرولیتر پروتئیناز K(mg/ml 10) اضافه کرده و به مدت 60 دقیقه در دمای 55 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس هم حجم آن به آن فنل تعادلی اضافه کرده و بخوبی مخلوط شد. سپس در 12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. فاز آبی را جدا کرده و هم حجم آن کلروفرم اضافه شد و به مدت 1 دقیقه مخلوط گشت. سپس به مدت 5 دقیقه در 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. سپس فاز آبی جدا شده و نصف حجمش به آن استات آمونیوم 7 مولار و برابر حجم کل به آن ایزوپروپانول اضافه شد. پس از 15 بار سر و ته کردن نمونه، حداقل به مدت یک ساعت در دمای20- ذخیره شد. سپس به مدت 15 دقیقه در 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب با 500 میکرولیتر اتانول 70% شستشو داده و پس از خشک کردن در دمای 65 درجه سانتی­گراد، به آن 12 میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه شد و پس از حل شدن 10 میکرولیتر برای واکنش PCR استفاده شد. جذب نوری آن در طول موج 260 نانومتر نیز اندازه­گیری شد.

برای استخراج DNA از روش Salting out نیز استفاده شد. به 500 میکرولیتر پلاسما 10 میکرولیتر پروتئینازK (10mg/ml) اضافه کرده و به مدت 60 دقیقه در دمای 55 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس 200 میکرولیتر کلرید سدیم 6 مولار به آن اضافه و مخلوط شد. سپس در 12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. فاز آبی جدا شده و هم حجمش به آن ایزوپروپانول اضافه گشت. پس از 15 بار سر و ته کردن نمونه، حداقل به مدت یک ساعت در دمای20- ذخیره شد. سپس به مدت 15 دقیقه 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب با 1 میلی لیتر اتانول 70% شستشو داده و پس از خشک کردن در دمای 65 درجه سانتیگراد، به آن 12 میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه شد و پس از حل شدن، 10 میکرولیتر آن برای واکنش PCR استفاده شد. همین­طور جذب نوری آن در طول موج 260 نانومتر اندازه­گیری شد. ( تعیین جنسیت با بررسی خون مادر )

برای استخراج DNA از روش Boiling اصلاح شده نیز استفاده شد. به 500 میکرولیتر پلاسما، 50 میکرولیتر سود 2 مولار اضافه شد و پس از مخلوط کردن به مدت 5 دقیقه در دمای 105 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از رسیدن دمای آن به دمای اتاق، 100 میکرولیتر اسید کلریدریک 6 مولار اضافه شد. سپس در 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ به مدت 10 دقیقه انجام گرفت. فاز آبی جدا شده و هم حجم آن به آن کلروفرم اضافه شد و به مدت 1 دقیقه مخلوط و سپس در 12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. فاز آبی جدا شده و هم حجمش به آن ایزوپروپانول اضافه شد. پس از 15 بار سر و ته کردن نمونه، حداقل به مدت یک ساعت در دمای20- ذخیره شد. سپس به مدت 15 دقیقه در 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب با 1 میلی لیتر اتانول 70% شستشو داده و پس از خشک کردن در دمای 65 درجه سانتیگراد، به آن 12 میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه شد و پس از حل شدن 10 میکرولیتر برای واکنش PCR استفاده شد. همینطور جذب نوری آن در طول موج 260 نانومتر اندازه­ گیری شد. ( تعیین جنسیت با بررسی خون مادر )

برای تعیین جنسیت جنین ما با استفاده از Nested-PCR بخشی از ژن SRY اختصاصی کروموزوم Y را تکثیر نمودیم. برای اپتیماسیون سیستم PCR، واکنش تکثیر بر روی DNA ژنومی استخراج شده از سرم مرد و زن بطور مجزا اجرا گردید و میزان مناسب اجزاء واکنش، زمان و دما تعیین گردید. شرایط اجرای واکنش بصورت زیر می­باشد:

در دور اول واکنش PCR، ما یک قطعه bp 343 از ژن اختصاصیSRY را به کمک جفت پرایمر

Y1(5′-TCG TGT GGT CTC GCG ATC AGA C-3′)                                                     Y2(5′-TGG CCT AGC TGG TGC TCC ATT G-3′

تکثیر نمودیم. مخلوط واکنش دور اول PCR در حجم 25 میکرولیتر شامل 10 میکرولیتر DNA پلاسما، 5 پیکومول هر یک ازپرایمرها،50 میکرومول dNTPs ،5 میلی­مولار MgCl2 ،100 میلی­مولار pH 9 Tris-HCl،500 میلی­مولار KCl، 1% Triton X-100 و 1 واحد Taq DNA polymerase بود. برنامه واکنش PCRدور اول به صورت 94 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه به عنوان دناتوراسیون اولیه و سپس سیکل اصلی واکنش شامل 94 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، 62 درجه سانتی­گراد به مدت 40 ثانیه، 72 درجه سانتی­گراد به مدت 50 ثانیه ، 43 دور تکرار گردید و مرحله آخر 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه به عنوان گسترش نهایی بوسیله سیستم ASTEC PCR (Japan) اجرا گردید.

در دور دوم واکنش PCR، 3 میکرولیتر از محصول PCR دور اول بعنوان DNA الگو در حجم کل 25 میکرولیتر با مقادیر یکسان با دور اول از نظر اجزاء واکنش همراه با پرایمرهای زیر اجراء گردید:

Y3 (5′-AATTACAGGCCATGCACAC-3′)

Y4 (5′-ATTCTTGAGTGTGTGGCTTTG-3′)

برنامه واکنش دور دوم PCR شامل دناتوراسیون اولیه 94 درجه سانتی­گراد به مدت 2 دقیقه، سپس 40 دور سیکل حرارتی اصلی، 94 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، 61 درجه سانتی­گراد به مدت 40 ثانیه، 72 درجه سانتی­گراد به مدت 50 ثانیه و یک مرحله گسترش 5 دقیقه­ای در دمای، 72 درجه سانتی­گراد اجراء شد. قطعه تکثیری دور دوم واکنش یک قطعه bp 190 بود.

 

یافته ­ها ( تعیین جنسیت با بررسی خون مادر )

روی پلاسمای 33 زن باردار در هفته های 8 تا 13 بطور مجزا سه روش استخراج DNA یعنی روش­های فنلی، Salting out و Boiling انجام شد. پیش از اجرای واکنش PCR روی آنها میزان جذب نوری هر نمونه در هر روش در طول موج­های 280، 260 و 230 نانومتر اندازه­گیری شد. متوسط DNA استخراج شده به روش Boiling، Salting out و فنلی از حجم یکسان پلاسمای 33 زن باردار به ترتیب معادل 35/1، 85/1 و 36/3 بود. میزان پروتئین و پلی­ساکارید در رسوب نهایی در روش Salting out بیشتر از روش Boilingو در روش Boiling بیشتر از روش فنلی بود.

نتایج بهینه­سازی سیستم بصورت Multiplex PCR روی DNA ژنومی زن و مرد در شکل 1 نمایش داده شده است. در این سیستم PCRباند اختصاصی Xو Y حضور این کروموزوم را در مخلوط DNAنشان می­دهد. در این تصویر همچنین تکثیر قطعات اختصاصی کروموزوم Xو Y بصورت Single PCR نیز اجرا گردیده است. بطوری­که حضور قطعه bp 343 نشان دهنده کرموزوم Yو حضور قطعه bp 211 نشان دهنده کروموزوم X می­باشد. زمانی­که DNAیک مرد تحت واکنش فوق قرار گیرد، بدلیل داشتن هر دو کروموزوم X و Y در محصول تکثیری هر دو قطعه bp343 و bp 211 مشاهده می­گردد. در حالی که وقتی DNA یک زن مورد بررسی قرار می­گیرد، بدلیل داشتن تنها کروموزوم X در محصول واکنش تنها قطعه bp 211 مشاهده می­گردد. ( تعیین جنسیت با بررسی خون مادر )

در این طرح ما با استفاده ازروش بسیار حساس Nested-PCR که قادر به شناسایی مقادیر جزئی DNA می­باشد و استخراج DNA به روش فنلی، سعی کردیم مقادیر جزئی DNA جنینی که از هفته هشتم وارد جریان خون مادر می­شود را شناسایی نماییم. برای این منظور، ما پرایمرهایی برای ژن SRY که تنها بر روی کروموزوم Y وجود دارد، طراحی نمودیم. پس از بهینه­سازی روش روی DNA ژنومی فرد مذکر و مونث، روش روی پلاسمای فرد مذکر، مونث و زنان باردار اجرا گردید. نتیجه Nested-PCR روی پلاسمای 32 زن با سن آبستنی 8 تا 12 هفته­ای و مقایسه آنها با نتیجه پس از زایمان میزان حساسیت 5/87 درصدی این روش را نشان داد. از میان این 32 مورد، 4 مورد نتیجه کاذب وجود داشت، بطوری­که سه مورد جنین مونث، مذکر و یک مورد جنین مذکر، مونث تشخیص داده شده بود. نتایج بدست آمده با نتایج Lo و Birch (9،4) که به حساسیت و اختصاصیت 100 درصدی دست یافته بودند، کمی کمتر است. نتایج بدست آمده نشان می دهد که روش استخراج فنلی هم از نظر مقدار DNA حاصله و هم از نظر عدم حضور سایر ماکرومولکول­ها همچون پروتئین و پلی­ساکاریدها که بعنوان مهار کننده­های واکنش عمل می­نمایند، در وضعیت بسیار مطلوبی قرار دارد. در حقیقت مقدار DNA بدست آمده در روش فنلی بیش از دو برابر روش­های Salting out و Boiling می­باشد. با توجه به استخراج دستی DNA آزاد پلاسما در این بررسی، شاید بتوان با استفاده از کیت­های استخراج DNA با کارایی بالا به نتایج بهتری دست یافت. در ضمن، از آنجایی­که جنس مونث، مذکر تشخیص داده شده و این موضوع ممکن است به خاطر آلودگی سرسمپلرها با نمونه­های DNA جنس مذکر باشد و همچنین با توجه به اینکه اکثر قطعات DNA جنینی در جریان خون مادر طولی کمتر از 300 جفت باز (2،11) دارند، با انجام آزمایش در شرایطی با استریلیتی بالاتر و با طراحی پرایمرهایی که قطعات کوچکتری را شناسایی می­نمایند، شاید بتوان حساسیت روش را بهبود بخشید. بطوری­که دست­یابی به این مهم می­تواند به ما در گشایش راه جدیدی برای تشخیص پیش از تولد و کاملا بی­خطر طیفی از اختلالات ژنتیکی کمک نماید. ( تعیین جنسیت با بررسی خون مادر )





تماس سریع

تماس با ما

تهران ، شهرک غرب ، بلوار فرحزادی ، 18 متری مطهری ، پلاک 168 ، بالای داروخانه دکتر مشرف ، طبقه اول


تلفن تماس مطب

021-22074065



دنبال کنید

فعالیت ما را در شبکه های اجتماعی

اطلاع از جدیدترین مقالات و اخبار



تمامی حقوق این سایت برای دکتر ویدا یوسفیان محفوظ است.

طرح و اجرا : شهر نِت

All rights reserved for Dr. Vida Yousefian            2018-1396